【實(shí)驗(yàn)原理】
細(xì)胞劃痕法是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法,類似體外傷口愈合模型,在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上,用微量槍頭或其他硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線,去除中央部分的細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,觀察周邊細(xì)胞是否生長(zhǎng)至中央劃痕區(qū),以此判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力,實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過(guò)不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)的修復(fù)能力,可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
細(xì)胞遷移:也成為細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動(dòng),是細(xì)胞在接受遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。
細(xì)胞遷移參與到很多生理和病理的活動(dòng)中,如下:
1. 免疫:如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一;
2. 炎癥:炎癥反映最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶,白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用;
3. 腫瘤轉(zhuǎn)移:遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)之一。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離,穿越血管壁,侵襲周邊正常組織時(shí),需要一定的運(yùn)動(dòng)能力。高轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通常具奮較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性。多種物質(zhì)可剌激腫瘤細(xì)胞的遷移,如腫瘤細(xì)胞分泌因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分(FN、LN)以及一些癌轉(zhuǎn)移靶器官的代謝產(chǎn)物或分泌產(chǎn)物等生長(zhǎng)因子對(duì)腫瘤細(xì)胞有趨化作用,可使其發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)。測(cè)定方法以細(xì)胞劃痕法和Transwell小室法;
4. 損傷修復(fù):當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí),免疫細(xì)胞和血小板會(huì)遷移到損傷部位,參與消炎和凝血;
5. 胚胎發(fā)育:胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特意靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。
【實(shí)驗(yàn)方法】
Culture Insert方法
1.準(zhǔn)備細(xì)胞,培養(yǎng)液,culture Insert。
2.如圖,將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert,細(xì)胞長(zhǎng)滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。
3.每隔4-6小時(shí)拍照記錄。
4.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法
1.培養(yǎng)板劃線
首先使用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃?rùn)M線,大約每隔0.5~1cm一道,橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。劃線時(shí)注意線不要太粗 。
2.鋪細(xì)胞
在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞(不同的細(xì)胞數(shù)量有所不同,根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)快慢調(diào)整),接種原則為過(guò)夜后融合率達(dá)到100%。
3.細(xì)胞劃線
第二天用槍頭或者無(wú)菌牙簽,垂直與細(xì)胞平面,沿著投一天劃在平板背面的線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕(不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽)。
4.洗細(xì)胞
劃痕完成后,使用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次,洗去不貼壁的細(xì)胞,即劃線時(shí)劃線的細(xì)胞,是劃線后留下的間隙清晰可見(jiàn),然后更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。
5.細(xì)胞培養(yǎng)、觀察
將細(xì)胞放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn),如0,6,12,24h取出細(xì)胞,顯微鏡線觀察并測(cè)量劃痕的寬度,并拍照(具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定)。
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見(jiàn)問(wèn)題】
1.鋪細(xì)胞最好使用6孔板,因?yàn)?空板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕,而且因?yàn)橛?條定位線,與劃痕相交,這樣就有10個(gè)可固定監(jiān)測(cè)點(diǎn),不作重復(fù),誤差也很小。當(dāng)然若是需要高通量初篩時(shí),也可以用12或24孔板。
2.如果你連續(xù)監(jiān)測(cè)24小時(shí),你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果,而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移,你可以先用絲裂霉素(1 μg/ml)處理一小時(shí),抑制細(xì)胞的分裂,這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外,使用無(wú)血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
3.照片拍完之后,可以用image J來(lái)測(cè)量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。
4.雖然無(wú)血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響,但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié),細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多。
5.在用PBS緩沖液沖洗時(shí),注意貼壁慢慢加入,以免沖散單層貼壁細(xì)胞。
6.為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響,盡量不要用吸泵,可用移液槍緩慢吸走。
【服務(wù)流程】