位置: 首頁
/ 科研技術(shù)服務(wù)
/ 病理學(xué)檢測(cè)
一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程,染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,在核小體單位之間被隨機(jī)切斷,形成180~200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端,從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè),這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)。
二、應(yīng)用簡介
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定,還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià),以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。
三、實(shí)驗(yàn)流程
四、 樣本送檢要求
五、 案例展示
六、常見問題
1、出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記
① 有些細(xì)胞或組織,例如平滑肌細(xì)胞或組織,nuclease或polymerase的酶活性水平較高,易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是,取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定,以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
② 使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?,例如一些酸性固定液,?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
③ TUNEL檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過長,或TUNEL檢測(cè)反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏,細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤,也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間,并確保TUNEL檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2、熒光背景很高
① 支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染。
② 高速分裂和增殖的細(xì)胞,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
③ TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)??梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
④ 紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。
3、標(biāo)記效率低
① 使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
② 固定時(shí)間過長,導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
③ 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
④ 碘化丙啶雙染時(shí),如果碘化丙啶染色過深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光,從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色,例如0.5μg/ml碘化丙啶。
七、服務(wù)流程