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【實驗原理】
細胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件,也是細胞運動和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素,并且對細胞的增殖、分化有重要影響。通常可分為兩類,即細胞與細胞黏附和細胞與基質(zhì)黏附。機體內(nèi)許多細胞,如上皮細胞,需要牢固地定在某處發(fā)揮功能;另一些細胞,如白細胞,活躍運動,就需要不斷調(diào)節(jié)細胞黏附。細胞黏附性的改變在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴散的能力,提示這些細胞在相互識別及黏附機制方面發(fā)生了改變。
【應用簡介】
細胞粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs) 是一類膜表面糖蛋白,它們以配體-受體特異性結(jié)合的方式介導細胞與細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)間的相互接觸和結(jié)合并調(diào)節(jié)細胞功能,在胚胎發(fā)育和分化、正常組織結(jié)構(gòu)的維持、炎癥反應、免疫應答、凝血和血栓形成、創(chuàng)傷修復、腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的生物學作用。
細胞粘附實驗通常分為兩類,即細胞與細胞粘附和細胞與基質(zhì)粘附。機體內(nèi)許多細胞,如上皮細胞固定在某處發(fā)揮功能;另一些細胞,如白細胞,活躍運動,就需要不斷調(diào)節(jié)細胞粘附。細胞粘附性的改變在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴散的能力,提示這些細胞相互識別及粘附機制發(fā)生了改變。用到測定細胞粘附性的實驗有:機械法測定細胞粘附性,發(fā)射性核素法測定細胞粘附性,細胞分離實驗和腫瘤細胞聚集體形成實驗。
【實驗方法】
1、將4.5×105個Hep3B細胞/孔傳代于無菌6孔培養(yǎng)板中。
2、培養(yǎng)24h后,用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細胞(兩個平行孔,Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7),轉(zhuǎn)染后的細胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),48h后收集細胞。同時各有兩個平行孔的細胞進行陰性對照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。?
3、培養(yǎng)48小時后收集細胞,用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細胞(約1×106個)從壁上消化下來并制成單細胞懸液。?
4、用無血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul(1:300)的人工基底膜膠備用。
5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul,放于超凈臺中風干過夜。?
6、96孔板每孔加入適量無血清MEM細胞培養(yǎng)液(或PBS或生理鹽水),放置60-90分鐘,洗去多余的膠;?
7、取轉(zhuǎn)染、陰性對照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞以4×103/孔接種在鋪膠的96孔板中,設3個重復孔,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)20min、40min、60min。?
8、在相應時間點取出96孔板,吸出培養(yǎng)液,用PBS洗3遍,洗去未粘附細胞。
9、每孔加入100?ul甲醇,固定15min。?
10、每孔加入100?ul姬姆薩染液,染色15min,蒸餾水洗去染液。?
11、在200倍顯微鏡下計數(shù)粘附細胞數(shù)量(每孔在固定位置取8個視野)
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
1、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。離心力在不損失細胞的前提下盡可能小,重懸細胞是動作要輕柔,避免多次反復的激烈吹打,不用渦旋振蕩器。
2、染色培養(yǎng)時間根據(jù)細胞種類的不同和每孔內(nèi)細胞數(shù)量的多少而異。一般情況下,白細胞較難染色,因此需要較長的培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間一般為1-?4小時,但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察。
3、染色程度?(根據(jù)細胞種類而定,需要摸索一下條件)。當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔?(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500?個/孔?(100μl培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入染色液B。?
4、有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔間的差異。加染色液B試劑時,建議斜貼著培養(yǎng)板壁加,不要插到培養(yǎng)基液面下加,容易產(chǎn)生氣泡,會干擾OD值讀數(shù)。?OD值在0.4-2.0之間均可,最大值控制在1.0左右為宜,小于0.4或大于2.0請調(diào)整接種量和培養(yǎng)時間。?
【服務流程】