位置: 首頁
/ 科研技術(shù)服務(wù)
/ 細胞實驗服務(wù)
【實驗原理】
穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達細胞株,指的是基于某一細胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達或干擾某特定基因的細胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應(yīng)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法,具有高效整合、目標細胞廣泛等特點。
將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白,或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。
【應(yīng)用簡介】
穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要應(yīng)用于以下研究中:
1、需要長期在目的細胞中研究基因功能。通過構(gòu)建穩(wěn)定株,可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本,也方便長期的實驗研究;
2、部分蛋白半衰期及長,瞬時RNA只能干擾表達,無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白,通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實驗更好的基因干擾效果;
3、瞬轉(zhuǎn)會引入不可預期的拷貝數(shù)表達(往往瞬時表達較高),導致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不精確,構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選到拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究;
4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以用于誘導表達系統(tǒng)的實驗,用于控制基因的時空表達;
5、需要用目的細胞構(gòu)建動物模型的實驗,往往需要構(gòu)建成穩(wěn)定株。
【實驗方法】
1、目的細胞的合適抗生素濃度篩選;
2、目的細胞的合適病毒滴度篩選;
3、慢病毒構(gòu)建與包裝與滴度測定;
4、慢病毒感染;
5、特定抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株;
6、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株鑒定。
【樣品送檢要求】
【案例展示】
(多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株)
(單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株)
【常見問題】
1.支原體污染問題
由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖,故被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發(fā),出現(xiàn)大量細胞碎片,甚至導致細胞死亡,導致穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的失敗。我們建議在穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建之初,務(wù)必排除細胞及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染。
2.其他問題
除支原體污染之外,還有以下問題會經(jīng)常出現(xiàn)于穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中。
【服務(wù)流程】