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科研技術(shù)服務(wù)
【實驗原理】
Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。
濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。
鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運動。細(xì)胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng)72小時后，有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過變形運動穿過濾膜，用這種模型對分析細(xì)胞運動能力和藥物對細(xì)胞運動能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。
【應(yīng)用簡介】
腫瘤細(xì)胞侵襲實驗（TumourInvasionAssay）可應(yīng)用于：
（1）研究各種細(xì)胞因子對惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響；
（2）一些抑制血管生成的新藥研究；
（3）研究腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制。
【實驗方法】
Step1：制備條件培養(yǎng)基
Step2：包被基底膜
Step3：水化基底膜
Step4：接種細(xì)胞
Step5：培養(yǎng)細(xì)胞
Step6：固定及染色
Step7：鏡檢
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
1、24孔板下室一般加入600ul的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡， 要將小空提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板；
2、接種的細(xì)胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好，細(xì)胞計數(shù)需準(zhǔn)確；
3、待細(xì)胞遷出，且形態(tài)展開后即可固定染色；
4、染色后，可用棉簽輕輕擦掉上層未遷出細(xì)胞；
5、拍照時，同一視野不可重復(fù)拍照，膜上小孔清晰，細(xì)胞形態(tài)明顯，所有照片的背景需統(tǒng)一。
【服務(wù)流程】
