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一、實(shí)驗(yàn)原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
目前使用的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法很多,其種類按檢測(cè)目的可分為:
間接法——用于測(cè)定抗體
雙抗體夾心法——主要用于測(cè)定大分子抗原
競(jìng)爭(zhēng)抑制法——主要用于測(cè)定小分子抗原
雙抗體夾心法(測(cè)抗原)
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體,經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品,如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在,即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合,經(jīng)保溫孵育洗滌后,即可加入酶標(biāo)記特異性抗體,再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色進(jìn)行測(cè)定,底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位,因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用,而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。
間接法測(cè)抗體
間接法首先用抗原包被于固相載體,這些包被的抗原必須是可溶性的,或者至少是極微小的顆粒,經(jīng)洗滌,加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本,再經(jīng)孵育洗滌后,加入酶標(biāo)記抗抗體,(對(duì)人的標(biāo)本來說即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM),再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色,底物降解的量,即為欲測(cè)抗體的量,其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定,本法用同種抗原包被固相載體后,只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白,即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。
競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面,我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過程,稱為包被(Coated),也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液,而另一組只加酶標(biāo)記抗原,再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為我們所要測(cè)定的未知抗原的量。
這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可,因此,對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快,因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)可以:(1)免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。(2)研究抗酶抗體的合成。(3)顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。(4)定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
三、實(shí)驗(yàn)方法
四、 樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1) 雙抗體夾心法(測(cè)抗原)
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式,這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體,如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。
2.包被所用的抗原必須是可溶性的,而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。
3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純,如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等,它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì),必須設(shè)法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經(jīng)提純是不能使用的。
4.用最適稀釋度抗原,包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì),而且可以克服前帶現(xiàn)象??赏ㄟ^棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定,但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便,其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值,選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。
5.抗原包被固相載體除濃度外,對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高(如37℃、45℃、或56℃),包被時(shí)間可縮短,溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見,通常采用4℃包被過夜,可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí),在堿性條件下(如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原)4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中,如用LPS或毒素蛋白包被時(shí),用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml,而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適,但均應(yīng)通過滴定。
2) 間接法(測(cè)抗體)
1.應(yīng)注意分離血清時(shí),血液要求放置室溫中凝固收縮,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。
2.為了使特異性結(jié)合的抗體量盡可能多,包被微量反應(yīng)板凹孔的抗原應(yīng)該稍微過量。
3.在孵育或洗滌過程中,已吸附的抗原可能有部份會(huì)從固相載體上被洗滌下來。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì)吸附到原來包被抗原凹孔的空白處,增加本底顏色,產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
4.在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護(hù)性阻劑可用來抑制非特異性蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。
5.在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng),而且還可增加陽性標(biāo)本的敏感度,這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS(含0.2‰KCL)加0.05%吐溫-20,如無吐溫-20,也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高,不宜應(yīng)用。
3) 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
1.試驗(yàn)的重復(fù)性(精確度)
有二種方法來檢驗(yàn)試驗(yàn)的精確度:通常用變異系數(shù)來表示:1、幾個(gè)樣品用ELISA法同時(shí)進(jìn)行多次測(cè)定求出CV%;2、不同時(shí)間對(duì)不同操作者對(duì)某幾個(gè)樣進(jìn)行多次測(cè)定求出變異系數(shù)。CV是個(gè)體參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比率。
S / X=CV,CV應(yīng)低10%,不應(yīng)大于10~15%。
不論目測(cè)或分光光度計(jì)測(cè)定,均可作一個(gè)稀釋度或一系列稀釋度測(cè)定,一般常規(guī)診斷只用一個(gè)稀釋度判斷陽性或陰性就可以了,這樣比較方便,現(xiàn)在推薦傳染病的血清診斷用1:200一個(gè)稀釋度。有些需要精確定量的,可作一系列稀釋度測(cè)定。
記錄結(jié)果有下列幾種方法:
1.“+”或“-”:所有超過規(guī)定的OD值(如OD,0.4)的標(biāo)本均屬陽性,此規(guī)定OD值是根據(jù)事先測(cè)定大量陰性標(biāo)本所取得的,此規(guī)定值是陰性標(biāo)本的上限?;蛘咭砸唤M陰性標(biāo)本OD平均值加2~3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性閾值。
2.直接以O(shè)D值來表示,如0.4、0.7、1.2,OD值越大,陽性反應(yīng)越強(qiáng),但此數(shù)值是在固定實(shí)驗(yàn)條件下得到的結(jié)果,而且每次實(shí)驗(yàn)都要有參考標(biāo)本作對(duì)照。
3.以終點(diǎn)滴度表示:將標(biāo)本作連續(xù)稀釋,最高稀釋度能出現(xiàn)陽性反應(yīng)者(即OD值仍大于陽性閾值,即為該標(biāo)本的滴度。
4.以“比值表示:求出被檢標(biāo)本的OD值與一組陰性標(biāo)本OD值的比值,例如為陰性標(biāo)本的2倍或3倍,即為陽性,比值小于2.1而大于1.5為可疑,<1.5為陰性。
測(cè)定標(biāo)本OD值-空白OD值
陰性對(duì)照OD值-空白OD值
如在此測(cè)定時(shí)以空白校正“O”點(diǎn)。
5.以“單位”來表示:在測(cè)定被檢標(biāo)本的同時(shí),再測(cè)定一個(gè)含已知單位數(shù)的陽性參考血清,用不同稀釋度作ELISA檢測(cè)后,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),單位數(shù)為橫坐標(biāo),畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后可根據(jù)被檢標(biāo)本的OD值,從曲線上找出相應(yīng)的單位數(shù),再乘于血清的稀釋倍數(shù),即可得出被檢標(biāo)本的單位數(shù)。
作試驗(yàn)時(shí)的陰性參考血清最好不要顯色,否則會(huì)對(duì)結(jié)果判斷帶來困難,特別在目測(cè)時(shí),當(dāng)陽性標(biāo)本OD值>2.0時(shí),應(yīng)作適當(dāng)稀釋后再作測(cè)定。
6.對(duì)使用儀器要求
所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔,用于酶結(jié)合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標(biāo)準(zhǔn)化。
七、服務(wù)流程