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科研技術(shù)服務(wù)
一、實驗原理
免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein G或A能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細(xì)胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于磁珠的Protein G或A，若細(xì)胞中存在與興趣蛋白相結(jié)合的目的蛋白，就可以形成蛋白復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”；最后通過免疫印跡實驗來檢測目的蛋白。
當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。Co-IP確定的存在相互作用關(guān)系，但這種相互作用并不能確定使用直接作用還是間接作用。
1) 免疫共沉淀的優(yōu)點
1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。
2. 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。
3. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
2) 免疫共沉淀的缺點
1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
2. 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
3. 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。
二、應(yīng)用簡介
Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作為常見的分子互作驗證方法。它們可以從檢驗的出發(fā)點來區(qū)分：co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白檢測體內(nèi)相關(guān)蛋白、DNA、RNA，并通過蛋白抗體免疫沉淀分離目標(biāo)蛋白、DNA、RNA。Pulldown則是根據(jù)已知RNA（RNA pulldown）或者已知蛋白（GST pulldown）體外檢驗相關(guān)蛋白。
Co-IP主要用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，是IP實驗的一種擴(kuò)展， 基于IP反應(yīng)的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(biāo)（抗原等）及通過天然相互作用靶標(biāo)結(jié)合的其他的大分子。此外，還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質(zhì)相互作用。
三、 實驗方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、實驗樣品制備方法準(zhǔn)備：根據(jù)研究目的，檢測樣品可能是組織樣品，也可能是細(xì)胞樣品，不同樣品制備流程不太相同，目的蛋白表達(dá)量也有較大差別，必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。
2、根據(jù)研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體：用于Co-IP實驗的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體，最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質(zhì)某個表位的抗體，且這個表位不會被任何其他蛋白質(zhì)相互作用所掩蓋，比普通WB抗體要求高出很多；同時，抗體特異性和靈敏性盡可能高，才有可能有干凈的背景和較好的IP效果，所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實驗。
3、未檢測到目得蛋白或蛋白很少：
4、目得蛋白高背景：
七、服務(wù)流程
