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一、實驗原理

DNA甲基化存在于大多數(shù)真核生物中，BSP甲基化測序通過對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，在隨后的PCR反應(yīng)中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基，在反應(yīng)完成時被保留，我們將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行TA克隆測序，可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實驗結(jié)果準(zhǔn)確性高，是甲基化檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

二、 應(yīng)用簡介

在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。

三、 實驗方法

四、 樣本送檢要求

五、案例展示

六、常見問題

1、蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；

2、RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。

3、驗證提取DNA的純度的方法有二：紫外分光光度計計算OD比值；2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。第二種方法可以完全明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。

4、基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。

5、所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要精確。

6、亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。

7、水浴最好達(dá)16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。?

8、在使用注射器時，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會將小柱內(nèi)的薄膜擠破，失去作用。?

9、乙酸銨、糖原不需新鮮配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因為這樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時也會有很多溶質(zhì)析出。

10、異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制，但如果用量大，現(xiàn)場配也很方便。?此步關(guān)鍵是在樹脂與DNA的結(jié)合上，這就再次強調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉PH值得重要性。因為樹脂與DNA結(jié)合需要有一個適當(dāng)?shù)腜H，如前一步?jīng)]做好，此步樹脂不能與DNA很好結(jié)合，將會帶來災(zāi)難性后果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時實際已沒有任何DNA了。??

11、PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。

12、凝膠DNA回收時在300nm紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡量小，保證特異性。

13、紫外照射時間不能過長，否則對DNA有損傷。?

14、回收后的DNA如不馬上用就儲存于-20度，在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。???

15、涂板要均勻，保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上；?

16、不要讓藍(lán)白斑長得太滿，否則選取克隆時容易一下挑2個。?

七、服務(wù)流程