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一、實(shí)驗(yàn)原理
DNA甲基化存在于大多數(shù)真核生物中,BSP甲基化測(cè)序通過對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,在隨后的PCR反應(yīng)中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基,在反應(yīng)完成時(shí)被保留,我們將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測(cè)序,可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性高,是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。
二、 應(yīng)用簡介
在惡性腫瘤的發(fā)展中,甲基化的狀態(tài)并不是一成不變,腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系,DNA甲基化檢測(cè)對(duì)腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
三、 實(shí)驗(yàn)方法
四、 樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1、蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml;
2、RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理,配制成10mg/ml。
3、驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二:紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值;2:1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。第二種方法可以完全明確所提基因組DNA的純度,并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度,以用于下一步的修飾。
4、基因組DNA的量不需十分精確,寧多勿少,因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失,且此方法修飾最多可至4ug。
5、所有試劑均須新鮮配制,所以配液的技術(shù)要過關(guān),既要快,又要精確。
6、亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性,一定用堿將PH調(diào)制5.0,否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收。
7、水浴最好達(dá)16小時(shí),雖可以短至8小時(shí),但后者修飾會(huì)有不完全。?
8、在使用注射器時(shí),一定要用力均勻且輕,如使用暴力,會(huì)將小柱內(nèi)的薄膜擠破,失去作用。?
9、乙酸銨、糖原不需新鮮配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸銨室溫即可,因?yàn)檫@樣濃度的乙酸銨非常難溶,一旦放在4度,取出用時(shí)也會(huì)有很多溶質(zhì)析出。
10、異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配制,但如果用量大,現(xiàn)場(chǎng)配也很方便。?此步關(guān)鍵是在樹脂與DNA的結(jié)合上,這就再次強(qiáng)調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉PH值得重要性。因?yàn)闃渲cDNA結(jié)合需要有一個(gè)適當(dāng)?shù)腜H,如前一步?jīng)]做好,此步樹脂不能與DNA很好結(jié)合,將會(huì)帶來災(zāi)難性后果,即DNA隨著液體被擠出了,洗脫時(shí)實(shí)際已沒有任何DNA了。??
11、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。
12、凝膠DNA回收時(shí)在300nm紫外燈下觀察條帶位置,切取目的片斷所在位置的凝膠,盡量小,保證特異性。
13、紫外照射時(shí)間不能過長,否則對(duì)DNA有損傷。?
14、回收后的DNA如不馬上用就儲(chǔ)存于-20度,在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。???
15、涂板要均勻,保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上;?
16、不要讓藍(lán)白斑長得太滿,否則選取克隆時(shí)容易一下挑2個(gè)。?
七、服務(wù)流程