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2022-06-09 10:06:22
實時熒光定量PCR檢測

一、 實驗原理

實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

 

二、應(yīng)用簡介

實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達(dá)量。

相關(guān)應(yīng)用

1.臨床疾病診斷

各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價;地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測;腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷;遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。

2.動物疾病檢測

禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

3.食品安全

食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。

4.科學(xué)研究

醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。

5.應(yīng)用行業(yè)

各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸,因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。

 

三、實驗方法 

 

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四、 樣本送檢要求

  

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五、案例展示

 

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六、 常見問題

1) 引物設(shè)計

1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段;

2、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp;

3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對;

4、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列獨特性,并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性,較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,降低了特異性,而且比短序列雜交慢,從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;

5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C;

6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基;

7、為避免基因組的擴(kuò)增,引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子;

8、探針位置盡可能地靠近上游引物;

9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G,引物的3’端避免使用堿基A。探針長度通常在25~35bp,Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C,GC含量在40%~ 70%;

10、整條探針中,堿基C的含量要明顯高于G的含量;

11、為確保引物探針的特異性,最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次,如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū),建議重新設(shè)計引物探針。

2) 熱啟動

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外,提高PCR特異性最重要的方法之一。

3) 鎂離子濃度

鎂離子影響PCR的多個方面,如:對DNA聚合酶的活性的影響進(jìn)而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響,進(jìn)而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合,則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。

4) 模板質(zhì)量

模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。

5) 防止殘余污染

1、PCR易受污染的影響,因為它是一種敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時,會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。

2、可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域,在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套??偸鞘褂貌缓心0宓年幮詫φ諜z測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份,而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。

 

七、服務(wù)流程

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