一、 實驗原理
慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,在細胞中進行病毒的包裝。包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。
二、應用簡介
慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1病毒為基礎發(fā)展起來的基因研究載體,區(qū)別于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對于分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。
實驗平臺的慢病毒系統(tǒng)屬于第三代慢病毒系統(tǒng),生物安全性高,采用VSVG包膜,宿主范圍廣泛,慢病毒滴度高,其病毒滴度可以達到10^9TU/mL。
目前的慢病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等多種啟動子可供選擇;而且還有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多種熒光標記蛋白可供選擇;抗生素篩選基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供選擇。
在細胞實驗中,對于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞,通過使用病毒介導的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導效率,達到目的基因高效表達的目的。
具體來說,慢病毒包裝主要應用于以下幾個方面:
1、對于難轉(zhuǎn)染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,極大地方便了RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究;
2、進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選;
3、為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液。
三、 實驗方法
四、樣本送檢要求
交付標準:
滴度:>108TU/ml
規(guī)格:1ml
贈送陰性對照病毒規(guī)格:0.2ml(>108TU/ml)
五、案例展示
六、常見問題
1.慢病毒理論上可以包裝5~7Kbp的片段,但過大的片段包裝會影響病毒的出毒效率,導致獲得的病毒滴度較低,影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以內(nèi)。
2.病毒載體易突變和丟失,克隆過程中可能出現(xiàn)質(zhì)粒的包裝信號突變或大小不等的片段丟失,導致無法成功包裝出病毒。因此建議構(gòu)建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進行測序,以確保關鍵序列都正確無誤。
3.包裝細胞多選擇為293T或293FT。要求細胞生長旺盛、狀態(tài)良好,避免過密生長和體外傳代次數(shù)過多。
4.轉(zhuǎn)染時對質(zhì)粒純度要求較高,最好為去掉內(nèi)毒素的超螺旋質(zhì)粒,以提高轉(zhuǎn)染效率。多采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法,既節(jié)約成本又可獲得高的轉(zhuǎn)染效率(一般可達到80%~95%)。
5.無論是三質(zhì)?;蛩馁|(zhì)粒慢病毒系統(tǒng),轉(zhuǎn)染的各質(zhì)粒之間的比例非常重要,直接影響出毒效率。不同公司提供的質(zhì)粒有所差別,因此無法一概而論,需要根據(jù)給出的比例進行調(diào)整優(yōu)化。
6.轉(zhuǎn)染前,細胞密度控制在50%~60%為佳。轉(zhuǎn)染前4~8h換液,轉(zhuǎn)染后不換液。轉(zhuǎn)染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率,之后8h再換液。每次換液前應將培養(yǎng)基預熱至37℃,換液時動作輕柔以防細胞漂起。
7.一般情況下,轉(zhuǎn)染48h后收獲得到的病毒顆粒最多,但也與當時細胞狀態(tài)、生長速度和培養(yǎng)基pH值有關。收獲病毒時培養(yǎng)基應呈紅色,若過酸呈現(xiàn)黃色則會降低病毒收獲率。
8.不同廠家和批次的血清對病毒的產(chǎn)量影響很大,需要篩選。
9.病毒液避免反復凍融,否則明顯降低效率。
10.一般情況下,病毒液于-80℃中可保存1年,但建議半年之后重新檢測病毒滴度。
七、服務流程