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科研技術(shù)服務(wù)
一、實驗原理
目前常用的腺病毒載體基于人腺病毒5型（Ad5），其基因組是36Kb長的線性雙鏈DNA。腺病毒可通過自身的纖維（fiber）和細(xì)胞表面的受體結(jié)合被內(nèi)吞進入細(xì)胞，然后從內(nèi)吞體（endosome）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，借助細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機器啟動病毒的復(fù)制組裝。一個完整的病毒生活周期會引發(fā)細(xì)胞死亡從而釋放出病毒粒子。
目前最常用的腺病毒包裝體系有AdEasy和AdMAX兩種，其共同特點是目的基因首 先克隆到穿梭載體，然后再重組到腺病毒的大骨架上。這兩個系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉(zhuǎn)錄 復(fù)制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因?qū)Σ《井a(chǎn)生并非必需。因此，腺病毒 包裝必需依賴表達E1的細(xì)胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。
相對于Adeasy系統(tǒng)，AdMAX系統(tǒng)操作便利，并且可以獲得更好的病毒滴度。本操 作說明均基于AdMAX系統(tǒng)，該系統(tǒng)由pHBAd系列穿梭質(zhì)粒、腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E1, 3Cre雙載體組成。
二、應(yīng)用簡介
腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV），是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復(fù)制。
重組腺病毒是一種復(fù)制缺陷的腺病毒載體系統(tǒng)，在基因治療、基礎(chǔ)生命科學(xué)研究等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。重組腺病毒具有以下幾個顯著優(yōu)點：感染范圍廣，幾乎可以感染所有的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織；感染效率高達100%，可全面超越其他病毒載體工具和脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染；對外源基因容載能力大（可以高達8Kb）；不整合基因組；滴度高，操作方便。 因此，重組腺病毒是一種最具有潛力的基因遞送工具。
實驗平臺的腺相關(guān)病毒血清型種類齊全，可提供AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ共10種血清型，而且還可以包裝雙鏈AAV（scAAV）。
腺相關(guān)病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、RK1、EF1a、GFAP等多種啟動子可供選擇；而且還有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多種熒光標(biāo)記蛋白可供選擇；同時可以提供誘導(dǎo)型AAV病毒的包裝，如Tet-On系統(tǒng)等。
可用于：常規(guī)基因過表達和干擾AAV定制； 組織特異性啟動子過表達AAV定制；組織特異性DIO AAV的定制（需結(jié)合組織特異性Cre工具鼠使用）；常規(guī)啟動子和組織特異性啟動子驅(qū)動的AAV-Cas9定制；AAV-mRFP-GFP-LC3自噬流監(jiān)測工具；各種AAV介導(dǎo)的光遺傳和化學(xué)遺傳載體現(xiàn)貨及改造服務(wù)等。
三、實驗方法
四、樣本送檢要求
滴度:>108TU/ml
規(guī)格:1ml
贈送陰性對照病毒規(guī)格:0.2ml（>108TU/ml）
五、案例展示
腺相關(guān)病毒各血清型載體體外感染細(xì)胞系
六、常見問題
1、高純度的低熔點瓊脂糖儲液可以配制在無菌PBS中，終濃度5%；使用之前用沸水浴完全融化， 然后自然降溫到45℃待用。用37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基稀釋5%的瓊脂糖溶液到終濃度1.25%，混勻后馬上加到去除培養(yǎng)基的細(xì)胞上，輕輕地覆蓋均勻。6孔板每孔覆蓋3 ml瓊脂糖/培養(yǎng)基。
2、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)。
3、收集細(xì)胞的時候一般使用細(xì)胞刮，不能用胰酶消化，4℃ 500′g離心10 min，去除大部分上 清，只留取2 ml上清重懸細(xì)胞沉淀進行-80℃（干冰或者液氮均可）凍融。
4、37℃凍融時一旦病毒融化就馬上取出，長時間在37℃溫育會降低病毒滴度，完全融化后可以劇烈 震蕩30s。凍融周期通常會持續(xù)2~4次才可以獲得高滴度的病毒。
細(xì)胞凍融結(jié)束裂解液可以4℃ 500×g離心10 min，不立即使用的話可以凍存在-20℃或-80℃。
七、服務(wù)流程
