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2022-06-09 10:08:11
腺相關(guān)病毒包裝

一、實(shí)驗(yàn)原理

目前常用的腺病毒載體基于人腺病毒5型(Ad5),其基因組是36Kb長(zhǎng)的線性雙鏈DNA。腺病毒可通過(guò)自身的纖維(fiber)和細(xì)胞表面的受體結(jié)合被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,然后從內(nèi)吞體(endosome)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi),借助細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器啟動(dòng)病毒的復(fù)制組裝。一個(gè)完整的病毒生活周期會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡從而釋放出病毒粒子。

目前最常用的腺病毒包裝體系有AdEasy和AdMAX兩種,其共同特點(diǎn)是目的基因首 先克隆到穿梭載體,然后再重組到腺病毒的大骨架上。這兩個(gè)系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉(zhuǎn)錄 復(fù)制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3),其中E3基因?qū)Σ《井a(chǎn)生并非必需。因此,腺病毒 包裝必需依賴表達(dá)E1的細(xì)胞系,例如HEK-293,HEK-293A等。

相對(duì)于Adeasy系統(tǒng),AdMAX系統(tǒng)操作便利,并且可以獲得更好的病毒滴度。本操 作說(shuō)明均基于AdMAX系統(tǒng),該系統(tǒng)由pHBAd系列穿梭質(zhì)粒、腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E1, 3Cre雙載體組成。

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二、應(yīng)用簡(jiǎn)介

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV),是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒,需要輔助病毒(通常為腺病毒)參與復(fù)制。

重組腺病毒是一種復(fù)制缺陷的腺病毒載體系統(tǒng),在基因治療、基礎(chǔ)生命科學(xué)研究等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。重組腺病毒具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn):感染范圍廣,幾乎可以感染所有的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織;感染效率高達(dá)100%,可全面超越其他病毒載體工具和脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染;對(duì)外源基因容載能力大(可以高達(dá)8Kb);不整合基因組;滴度高,操作方便。 因此,重組腺病毒是一種最具有潛力的基因遞送工具。

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的腺相關(guān)病毒血清型種類齊全,可提供AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ共10種血清型,而且還可以包裝雙鏈AAV(scAAV)。

腺相關(guān)病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、RK1、EF1a、GFAP等多種啟動(dòng)子可供選擇;而且還有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多種熒光標(biāo)記蛋白可供選擇;同時(shí)可以提供誘導(dǎo)型AAV病毒的包裝,如Tet-On系統(tǒng)等。

可用于:常規(guī)基因過(guò)表達(dá)和干擾AAV定制;  組織特異性啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)AAV定制;組織特異性DIO AAV的定制(需結(jié)合組織特異性Cre工具鼠使用);常規(guī)啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AAV-Cas9定制;AAV-mRFP-GFP-LC3自噬流監(jiān)測(cè)工具;各種AAV介導(dǎo)的光遺傳和化學(xué)遺傳載體現(xiàn)貨及改造服務(wù)等。

 

三、實(shí)驗(yàn)方法

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四、樣本送檢要求

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滴度:>108TU/ml

規(guī)格:1ml

贈(zèng)送陰性對(duì)照病毒規(guī)格:0.2ml(>108TU/ml)

 

五、案例展示

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腺相關(guān)病毒各血清型載體體外感染細(xì)胞系

 

六、常見(jiàn)問(wèn)題

1、高純度的低熔點(diǎn)瓊脂糖儲(chǔ)液可以配制在無(wú)菌PBS中,終濃度5%;使用之前用沸水浴完全融化, 然后自然降溫到45℃待用。用37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基稀釋5%的瓊脂糖溶液到終濃度1.25%,混勻后馬上加到去除培養(yǎng)基的細(xì)胞上,輕輕地覆蓋均勻。6孔板每孔覆蓋3 ml瓊脂糖/培養(yǎng)基。

2、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3、收集細(xì)胞的時(shí)候一般使用細(xì)胞刮,不能用胰酶消化,4℃ 500′g離心10 min,去除大部分上 清,只留取2 ml上清重懸細(xì)胞沉淀進(jìn)行-80℃(干冰或者液氮均可)凍融。

4、37℃凍融時(shí)一旦病毒融化就馬上取出,長(zhǎng)時(shí)間在37℃溫育會(huì)降低病毒滴度,完全融化后可以劇烈 震蕩30s。凍融周期通常會(huì)持續(xù)2~4次才可以獲得高滴度的病毒。

細(xì)胞凍融結(jié)束裂解液可以4℃ 500×g離心10 min,不立即使用的話可以凍存在-20℃或-80℃。

 

七、服務(wù)流程

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