精品国产Ⅴ无码大片在线观看81|狠狠色噜噜狠狠狠狠7777米奇|久久天天躁狠狠躁夜夜2020一|2021最新亚洲国产成人a在线|国产毛片久久久久久国产毛片不卡|99久久2023re6热精品首页|久久久精品国产亚洲未满成18免费网站

細胞遷移是指細胞在外部信號的驅動下，從一個特定位置遷移到另一個位置的復雜生物過程。在生物體內，這一過程在多個生理和病理學情境下發(fā)揮著關鍵作用，包括但不限于損傷修復、腫瘤轉移、免疫細胞的遷移以及組織修復等生命活動。

在腫瘤學研究中，評估腫瘤細胞侵襲性是一項至關重要的測量標準，可用于評估與腫瘤相關的信號通路、藥物治療、靶向治療以及致癌/抑癌基因的效果。因此，在腫瘤研究中，經常需要對腫瘤細胞的侵襲能力進行全面的測試。為此，Transwell實驗被廣泛采用，作為一種常見的實驗方法，用于精確評估細胞的遷移和侵襲能力。這一實驗系統(tǒng)通過模擬生理環(huán)境，為研究者提供了獨特的平臺，使其能夠深入探究腫瘤細胞在侵襲性方面的特性和機制。

Transwell實驗，又被稱為Transwell遷移或侵襲測定，是一項在細胞生物學和分子生物學領域廣泛應用的實驗室技術，其主要目的是研究細胞在多孔膜上的運動機制。該實驗常用于研究細胞對各種刺激，如生長因子、趨化因子或細胞外基質成分，引發(fā)的遷移、趨化性和侵襲行為。Transwell實驗對評估細胞穿越多孔屏障進行遷移或侵襲的能力特別有益，因為多孔屏障模擬細胞在體內組織的生理條件下的移動。

Transwell實驗包括Transwell小室（插入物）和孔板，這是一種由滲透膜隔離的裝置，用于劃分兩個隔室。通常，頂部室中充滿細胞，而底部室則含有化學引誘劑或誘導細胞遷移的物質。多孔膜允許細胞通過膜上的微小孔從頂部室遷移到底部室。

根據是否在小室內添加基質膠，Transwell實驗分為兩種類型：

遷移測定（未添加基質膠）： 在這種測定中，細胞從頂部室遷移到底部室，但無需降解或侵入膜。這一類型的測定旨在評估細胞對化學引誘劑梯度的響應，展示其移動能力。

侵襲測定（需添加基質膠）： 在侵襲測定中，細胞不僅通過多孔膜遷移，還需要通過通常涂覆在膜頂部的細胞外基質（ECM）層降解或侵襲。例如，侵襲測定常用于研究腫瘤細胞的侵襲行為。

作為研究細胞行為的關鍵工具，Transwell實驗不僅可以深入了解癌癥轉移、免疫細胞遷移和組織發(fā)育等多種生物過程，還通過計算遷移或侵襲的細胞數量，或測量各種細胞參數（如細胞運動和趨化反應）的變化，來量化細胞行為。

1.測定細胞的遷移能力

2. 測定細胞的侵襲能力

3. 對細胞遷移和侵襲能力有影響作用的藥物藥效評價

（一）、基底膜水化前處理：

在進行Transwell遷移/侵襲實驗之前，需要對基底膜進行水化處理，以確保適當的細胞遷移環(huán)境。

具體步驟如下：

每個孔中加入50 μl無血清培養(yǎng)液，然后在37℃的室溫下進行30分鐘的基底膜水化。這個步驟有助于提供一個適當的基質環(huán)境，為細胞的遷移和侵襲提供必要的條件。

（二）、細胞懸液制備：

首先，將細胞處于饑餓狀態(tài)，去除細胞周圍的血清影響，通常需要饑餓12～24小時。

消化細胞后，通過離心將培養(yǎng)液去除，并使用PBS洗滌1～2次，確保細胞的純凈性。

使用含有BSA的無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，調整細胞密度至5×10^5 個/ml。這一步確保在Transwell小室中接種的細胞懸液具有適當的濃度。

（三）、細胞接種：

取100 μl的細胞懸液，加入Transwell小室中。這一步將細胞懸液均勻地分布在Transwell小室的頂部。

在孔板的下室中加入600 μl含有10% FBS的培養(yǎng)基。這一步提供了一種引導細胞遷移的環(huán)境，促進細胞通過基底膜向下室遷移。

根據實驗需要，培養(yǎng)細胞的時間通常為12～48小時，主要依據細胞的遷移能力而定。這一步允許細胞逐漸遷移穿過基底膜，模擬體內細胞的遷移過程。

（四）、結果統(tǒng)計步驟

一、直接計數法

a）“貼壁”細胞計數：

在這一步驟中，關注的是細胞在膜下層黏附的情況，可以通過染色方式標記這些細胞，例如結晶紫染色、臺盼藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色。以下是詳細的操作步驟：

細胞固定：小心地取出Transwell小室，吸去上室內的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭Matrigel和上室內的細胞。然后，在一個新的24孔板中加入600μL的4%多聚甲醛，將小室放入其中進行固定，固定時間為20-30分鐘。

細胞染色：吸去上室內的固定液后，將小室移至預先加入約800μL 0.1%-0.2%結晶紫染料的孔中，讓細胞染色15-30分鐘。接下來，去除未與細胞結合的結晶紫，通過輕輕用棉簽擦拭小室的上側，去掉那些非特異性地附著在小室上表面的染料，以便在后續(xù)的鏡檢中進行計數。

細胞計數：輕輕用清水多次沖洗，將小室取出后，吸干上室內的液體。然后，使用濕棉棒小心地擦拭上室底部膜表面上的細胞。接下來，小心地使用鑷子將膜揭下，確保底面朝上，然后等待適當的時間使其風干。將膜轉移到載玻片上，并使用中性樹膠進行封片。在高倍顯微鏡下觀察和拍照，隨機選擇5個視野（包括上、下、中央、左、右各一個），并計數呈紫色的陽性細胞，最后統(tǒng)計結果。

b）“非貼壁”細胞計數：

由于細胞特性或膜的性質，有些細胞在穿過膜后無法附著在膜的表面，而是掉入下室。在這種情況下，可以選擇兩種方法計數細胞數量：一是收集下室內的培養(yǎng)液，然后使用流式細胞儀計數；二是直接在顯微鏡下進行細胞計數。

二、間接計數法

a）MTT法：

MTT可以穿透細胞膜并進入細胞內，在細胞內還原為藍紫色晶體。通過測定其光吸收值在490nm波長下，可以間接反映活細胞的數量。這種方法廣泛用于測定生物活性因子的活性、篩選抗腫瘤藥物、進行細胞毒性實驗以及評估腫瘤對放射線的敏感性等。

b）結晶紫檢測：

該方法的原理與MTT法相似，通過在細胞染色后使用3%醋酸進行脫色，然后測定洗脫液的光密度值（波長為570nm），間接反映細胞的數量。

1.在進行基底膜鋪膠的過程中，基質膠在室溫下會迅速凝固，因此整個過程需要在冰上進行操作，以確保膠液不會提前凝固。

2.基質膠的濃度是影響細胞遷移和侵襲的重要因素之一。因此，根據供應商提供的信息和具體實驗情況，需要調整基質膠的濃度和稀釋比例。一般常用濃度為1mg/mL。

3.鋪膠時，建議垂直向小室底部中間加入基質膠，以最大程度避免氣泡的產生。

4.吸出小室內未結合的基質膠時，務必確保移液管的尖端不會刮傷凝膠層表面，以維持凝膠的完整性。

5.不同細胞具有不同的遷移和侵襲能力，可以設置一系列細胞密度梯度，以尋找適當的細胞接種密度。

6.在小室放置過程中，容易產生氣泡。一旦氣泡產生，下層培養(yǎng)液的趨化作用可能會減弱或消失。因此，在小室放置過程中需要格外注意。一旦發(fā)現氣泡，需要及時提起或使用槍頭去除，然后重新放置。

7.接種細胞后的1-2小時內，建議對培養(yǎng)板進行檢查，確保沒有大氣泡產生。盡管有時可能會觀察到極小的氣泡，但它們通常不會影響細胞的遷移和侵襲，可通過輕輕敲擊孔板來去除。

8.在用PBS清洗小室時，避免物理觸碰小室底部?？梢允孪葴蕚鋷讉€無菌燒杯或培養(yǎng)皿，倒入適量PBS，然后依次涮洗，以提高清洗效率。

9.在拍照前，需要適當晾干小室，因為水分會影響鏡下視野。確保小室表面干燥，以獲取清晰的圖像。