【實(shí)驗(yàn)原理】
將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理,分散成單細(xì)胞,置于合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。
原代細(xì)胞保留了很多來源組織的重要生理特性,能高度模仿體內(nèi)的情況,且沒有遺傳和化學(xué)的改變。因此,原代細(xì)胞成為許多研究中理想的細(xì)胞模型。
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。通過原代分離獲得的細(xì)胞具有與體內(nèi)細(xì)胞相似的生物學(xué)特征,是研究生物體相關(guān)生命活動(dòng)的理想材料。
【實(shí)驗(yàn)方法】
(一)懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
(二)實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。其中,機(jī)械分散法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大,而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),使團(tuán)塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機(jī)械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)后,細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
(三)小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)
1、取肝臟:將小鼠斷頸致死,取肝臟;
2、除雜物:剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物;
3、研磨肝臟:用手術(shù)剪將臟器剪成小塊并研磨;
4、胰酶消化:加入胰酶消化,使細(xì)胞分離;
5、濾網(wǎng)去雜:用濾網(wǎng)過濾,除去大組織塊;
6、細(xì)胞計(jì)數(shù):血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
【樣本送檢要求】
【案例展示】
【常見問題】
(1)原代培養(yǎng)材料的選擇,盡量選取繁殖能力較強(qiáng)的組織,如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
(2)要注意無菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)、
(3)整個(gè)取材操作要迅速,時(shí)間不能過長(zhǎng),以確保胚胎細(xì)胞活性。
(4)運(yùn)用消化法時(shí)胰酶溫度應(yīng)低于37℃,濃度只需平時(shí)消化細(xì)胞濃度的一半。因?yàn)榇诉^程不像消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的1~10min,而是至少20min,先消化下來的細(xì)胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強(qiáng),否則這些細(xì)胞易被損傷而不易生存。
(5)如使用組織塊法,則應(yīng)待組織塊略干燥,能黏附于瓶壁時(shí)再使之與培養(yǎng)液接觸,匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁,則細(xì)胞不易生長(zhǎng),即使生長(zhǎng)也因沒有貼在瓶壁上,從而因不能觀察到而無法收集到生長(zhǎng)的細(xì)胞。
(6)原代培養(yǎng)操作時(shí),也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
【服務(wù)流程】