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在分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究領(lǐng)域，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)常用于檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。MMPs是一類在細(xì)胞外基質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白酶，而MMP2和MMP9作為其中的代表性成員，對(duì)于細(xì)胞遷移、侵襲和組織修復(fù)等生理過程至關(guān)重要。因此，準(zhǔn)確測(cè)定MMP2和MMP9的活性對(duì)于深入了解細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和疾病發(fā)展機(jī)制具有重要意義。 本文將重點(diǎn)介紹明膠酶譜實(shí)驗(yàn)在MMP2和MMP9活性檢測(cè)中的應(yīng)用。詳細(xì)探討實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟、試劑的合理配置以及實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的細(xì)節(jié)。
簡(jiǎn)介
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）扮演著細(xì)胞內(nèi)重要的生存支持系統(tǒng)，其組成不僅包括膠原、糖蛋白、蛋白多糖等元素，還富含大量的蛋白酶、細(xì)胞因子以及黏附分子。在腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過程中，ECM的基底膜特別是一個(gè)生理屏障，必須被克服?；|(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）則能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞克服這一屏障，為細(xì)胞增殖提供必要的空間。MMP2和MMP9是主要負(fù)責(zé)降解基底膜上IV型膠原和明膠的基質(zhì)金屬蛋白酶，它們與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。通過蛋白電泳技術(shù)，可以檢測(cè)MMP2和MMP9的活性。 MMP2和MMP9之前被稱為明膠酶A和B，因?yàn)樗鼈兡軌蛄呀庾冃缘哪z原蛋白或明膠。
MMP的分類（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
明膠酶譜法可用于： （1）明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9）的測(cè)定； （2）測(cè)定明膠酶的抑制劑； （3）細(xì)胞與組織中明膠酶的定位。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1.實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞勻漿，組織提取物。
2.試劑、試劑盒： 聚丙烯酰胺凝膠、明膠、濃縮膠、Tris-甘氨酸緩沖液、Triton X-100、過 硫 酸 銨、甲醇、醋酸、考馬斯亮藍(lán)、蛋白質(zhì)上樣緩沖液。
3.儀器、耗材： 電泳糟、pH計(jì)、凝膠成像儀、離心機(jī)、電泳儀、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、液氮罐、微型旋轉(zhuǎn)柱、旋轉(zhuǎn)混合儀。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、主要試劑的配制 1、平衡緩沖液：50 mmol/L Tris（pH7.5），0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol/L 鄰二氮菲。 2、洗滌緩沖液1：50 mol/L Tris（pH7.5），0.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，0.05％Tween 20，5 mmol/L鄰二氮菲。 3、洗滌緩沖液2：50 mmol/L Tris（pH7.5），10 mmol/L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol/L鄰二氮菲。 4、8％分離膠（含0.1％明膠）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol/L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 過硫酸銨（APS）100 μl，TEMED 6 μl。 5、濃縮膠：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol/L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％ SDS 30 μl，10％過硫酸銨30 μl，TEMED 3 μl。 6、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：0.125 mol/L Tris-HCl，1.25 mol/L 甘氨酸，0.5％ SDS。 7、5×上樣緩沖液：30％ 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚藍(lán)。 8、洗脫液：2.5％ TritonX-100（去離子水定容）。 9、孵育液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，1％ TritonX-100，pH7.5，去離子水定容。 10、染色液：0.25％考馬斯亮藍(lán)R-250，45％甲醇，10％乙酸。 11、脫色液：30％甲醇，10％乙酸。
二、實(shí)驗(yàn)方法 1、收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的癌細(xì)胞培養(yǎng)液。 2、將500μl培養(yǎng)液，45μl明膠瓊脂糖顆粒（使用前混勻）和45μl平衡緩沖液混合均勻后加入微型旋轉(zhuǎn)柱中，于旋轉(zhuǎn)混合儀上平衡30min。 3、用洗滌緩沖液1洗滌瓊脂糖顆粒，每次100μl洗滌3次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液1。 4、用100μl洗滌緩沖液2洗滌瓊脂糖顆粒1次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液2。 5、向微型旋轉(zhuǎn)柱中加入40μl的2x上樣緩沖液，7000r/min離心。將離心后的上樣緩沖液重新加入微型旋轉(zhuǎn)柱中，于12000r/min離心10s。 6、采用8%分離膠在130V恒壓下電泳2.5h。 7、用洗脫液在搖床上洗滌蛋白膠2次，各30min，除去膠中的SDS。 8、37℃孵育蛋白膠24h，使MMP分解明膠。 9、搖床上染色1h及脫色至條帶清晰。 10、蛋白成像：用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。
三、實(shí)驗(yàn)流程
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
注意事項(xiàng)
（1）在合成聚丙烯酰胺的過程中，需要特別留意排除氣泡。 （2）活性明膠酶譜受到多種因素的調(diào)控，包括鈣離子、鋅離子以及pH值等。因此，在配制緩沖液時(shí)應(yīng)確保準(zhǔn)確無誤，最好選用超純水。此外，需嚴(yán)格控制孵育溫度，以確保最佳的酶活性。 （3）為了避免樣品中的酶發(fā)生變性和失活，不建議對(duì)蛋白樣品進(jìn)行沸騰處理，且在上樣緩沖液中應(yīng)避免含有β-巰基乙醇或DTT。 （4）為了最優(yōu)效果，建議孵育液的pH保持在7.5到7.6之間。使用經(jīng)過復(fù)性處理的Triton過長(zhǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致產(chǎn)生絮狀物，因此在實(shí)驗(yàn)中最好采用新鮮配置的溶液。 （5）建議在普通的孵化箱中，而非CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行37℃的孵育，因?yàn)镃O2培養(yǎng)箱可能改變孵育液的pH值。 （6）明膠要4℃保存，配好后1周內(nèi)使用。