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新聞資訊
01 簡介
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇是一種用于長期儲存細(xì)胞的技術(shù)。在這個過程中，細(xì)胞被置于低溫環(huán)境中，減緩其代謝活動。通過將細(xì)胞冷凍保存在液氮中（通常為-196℃），細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)，但其細(xì)胞特性得以保存。當(dāng)需要時，可以通過復(fù)蘇將這些凍存的細(xì)胞重新激活，以供實(shí)驗(yàn)使用。這種方法能夠適度地保存一定數(shù)量的細(xì)胞，防止細(xì)胞受到污染或其他意外事件的影響，從而發(fā)揮了細(xì)胞保種的作用。
02 原理
細(xì)胞凍存原理：
細(xì)胞凍存的原理在于降低細(xì)胞溫度至零度以下時，會引起以下變化：細(xì)胞器會脫水，細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)濃度增加，并形成冰晶。 緩慢冷凍的過程可以逐漸使細(xì)胞脫水，以防止細(xì)胞內(nèi)形成大冰晶。因?yàn)榇蟊Э赡軐?dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷和破裂。而快速復(fù)蘇的目的是防止小冰晶再次結(jié)合成大冰晶，即防止冰晶的再結(jié)晶過程。
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低溫保護(hù)劑的應(yīng)用原理：
1. 增加滲透壓穩(wěn)定性：在細(xì)胞凍存過程中，加入低溫保護(hù)劑可以增加細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定性，從而減緩細(xì)胞在慢速降溫過程中的脫水和皺縮現(xiàn)象，顯著提高了凍存效率。 2. DMSO的作用：常用的低溫保護(hù)劑是DMSO（二甲基亞砜），它是一種滲透性保護(hù)劑。DMSO能夠迅速透入細(xì)胞，并提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩了凍結(jié)過程。這樣一來，細(xì)胞在凍結(jié)前會透出水分到細(xì)胞外部，在細(xì)胞外形成冰晶，從而減少了細(xì)胞內(nèi)部的冰晶形成，有效減少了冰晶對細(xì)胞的損傷。
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03 實(shí)驗(yàn)步驟
1 材料準(zhǔn)備 1.儀器：凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。 2.玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、廢液缸。 3.塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10 ml）、15 ml 離心管、凍存管（1～2 ml）。 4.其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。 5.試劑：D-Hanks 液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。 2 細(xì)胞凍存 1. 配制凍存培養(yǎng)液：配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。 2. 處理細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，使用胰蛋白酶將單層生長的細(xì)胞消化下來，對于懸浮生長的細(xì)胞，直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。 3. 離心：進(jìn)行1,000 rpm，5分鐘的離心。 4. 調(diào)整細(xì)胞密度：去除胰蛋白酶和舊的培養(yǎng)液，加入適量的配制好的凍存培養(yǎng)液。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×10^6/ml～1×10^7/ml。 5. 分裝細(xì)胞：將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。 6. 標(biāo)記凍存管：在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱、凍存時間及操作者。 7. 凍存過程：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；直到-100℃時，可迅速浸入液氮中。另一種方法是將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2小時，然后放入-70℃冰箱中過夜，最后將凍存管移入液氮容器中。 細(xì)胞凍存步驟（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)） 3 細(xì)胞復(fù)蘇 細(xì)胞復(fù)蘇的步驟如下： 1. 取出凍存管：從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動，促使其盡快融化。 2. 處理細(xì)胞懸液：從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，將其加入離心管中，并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，然后混勻。 3. 離心：進(jìn)行1,000 rpm，5分鐘的離心。 4. 調(diào)整細(xì)胞密度：棄去上清液，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液以重懸細(xì)胞。進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后，將其接種到培養(yǎng)瓶中，并置于37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。 5. 繼續(xù)培養(yǎng)：次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。 細(xì)胞復(fù)蘇方法（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
04 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇注意事項(xiàng)
1. 確保細(xì)胞狀態(tài)良好：在凍存之前，確保細(xì)胞具有良好的形態(tài)，并且沒有污染。 2. 選擇適合的凍存液：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的凍存液，并按照相應(yīng)的操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞的凍存。 3. 控制細(xì)胞密度：要控制好細(xì)胞的密度，避免過低或過高影響凍存效果。不同的凍存液針對不同細(xì)胞有適當(dāng)?shù)膬龃婷芏确秶?，以確保細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過程中的存活率。 4.盡快冷凍：細(xì)胞懸液加入凍存液后盡量短時間在常溫放置，因?yàn)槌叵翫MSO對細(xì)胞會造成損傷。建議盡快通過程序降溫或一步法等方式進(jìn)行細(xì)胞的冷凍保存。 5. 合理存放：細(xì)胞長期存放在-80℃冰箱時，建議靠冰箱內(nèi)側(cè)放置樣本，避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定影響細(xì)胞保存效果。 6. 檢測存活率：細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管進(jìn)行復(fù)蘇，并檢測細(xì)胞的存活率。為穩(wěn)妥起見，可在細(xì)胞凍存半年后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞生長情況后繼續(xù)凍存。 7. 溫和解凍：使用適當(dāng)?shù)姆椒ń鈨黾?xì)胞，如將凍存管放入37°C的水浴中直至完全解凍。避免使用高溫或暴露時間過長的方法，以減少DMSO對細(xì)胞的毒性作用。 8. 勻速搖晃：細(xì)胞融解過程應(yīng)勻速、均一地?fù)u晃以加速融解，同時避免流體剪切力對細(xì)胞的損傷。 9.盡快去除DMSO：已融解的凍存細(xì)胞應(yīng)盡快在常溫下存放，并盡快離心去除DMSO。