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新聞資訊
01 簡介
彗星實驗，又稱單細(xì)胞凝膠電泳實驗，是一種用于評估DNA鏈損傷程度的技術(shù)，最早由Ostling等人在1984年提出。該方法可以有效地檢測和量化細(xì)胞中DNA單鏈和雙鏈斷裂的程度。彗星實驗對低濃度的遺傳毒物具有高度敏感性，可用于研究細(xì)胞無需處于有絲分裂期，并且只需少量細(xì)胞即可進(jìn)行。
圖片來源：Bio-Techne
02 實驗原理
彗星實驗，是一種有效評估DNA損傷程度的方法。其基本原理是，在處理器官或組織后（如輻射或重金屬暴露），細(xì)胞內(nèi)的DNA可能會出現(xiàn)單鏈或雙鏈斷裂。在細(xì)胞裂解后，DNA會解旋并遷移出核，然后在電場的作用下形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的DNA在電場作用下會遷移較短的距離，保持在核內(nèi)，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。 根據(jù)電泳緩沖液的pH值，彗星實驗可分為中性（pH=8.4）和堿性（pH＞13）兩種類型。中性實驗主要用于檢測DNA雙鏈斷裂，而堿性實驗則更為敏感，可檢測到更少量的單鏈和雙鏈斷裂。 在進(jìn)行實驗時，樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)（如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度）以及環(huán)境條件（如背景照明）等方面都需要仔細(xì)控制，因為它們可能會影響到DNA的遷移。
圖片來源于網(wǎng)絡(luò)
03 用途
評價單個細(xì)胞的 DNA 損傷(各種因素的生物反應(yīng)、腫瘤的研究治療預(yù)測)
04 實驗步驟
1.單細(xì)胞懸液制備： - 使用胰酶消化細(xì)胞至離心管中，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。 - 使用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至每毫升105~106個。 2.制膠： - 在預(yù)熱的載玻片上滴加第一層0.5%正常熔點瓊脂糖，然后迅速蓋上干凈的蓋玻片，置于4°C靜置10分鐘使其凝固。 - 準(zhǔn)備混合液，將10微升含有10000個細(xì)胞的PBS和75微升10.5%低熔點瓊脂糖在37°C混勻，然后輕輕揭去蓋玻片，將含有細(xì)胞的低熔點瓊脂糖滴到第一層膠板上，立即蓋上干凈的蓋玻片，再次置于4°C靜置10分鐘使其凝固。第三層膠的制備與第一層相同，然后再次蓋上蓋玻片。 3. 裂解： - 移除蓋玻片，將載玻片浸入新配置的RIPA細(xì)胞裂解液中，至少裂解2.5小時（盡量使每張玻片裂解時間相同）。此步驟的目的是通過去垢劑和高鹽溶液除去溶解細(xì)胞膜和核膜，除去蛋白質(zhì)、RNA等，僅留下核骨架。 4.解旋和電泳： - 細(xì)胞裂解后，取出載玻片，用PBS沖洗2次，然后將載玻片置于水平電泳槽中。 - 倒入1XTBE電泳緩沖液，覆蓋膠面0.25厘米，進(jìn)行堿解旋20分鐘，然后在4°C冰箱中電泳25~30分鐘，電壓設(shè)置為25V。 5. 染色： - 將載玻片取出，用濾紙吸干電泳緩沖液，然后用Tris-HCl(pH 7.5)中和15分鐘。 - 然后在每片載玻片上滴加50微升30ug/mL的溴化乙錠(EB)溶液，進(jìn)行避光操作。 - 蓋上蓋玻片，避光染色20分鐘。 6. 鏡檢核圖像分析： - 盡快將EB染色后的樣本放置在熒光顯微鏡下觀察，并拍攝電泳圖譜的圖像。
圖片來源于網(wǎng)絡(luò)
05 注意事項
1.細(xì)胞密度控制： 細(xì)胞需要被準(zhǔn)確計數(shù)，以確保每張凝膠上的細(xì)胞密度為1×10^4個/ml。密度過大會導(dǎo)致軟件分析困難，而密度過小則會增加工作量，因為單個視野下的細(xì)胞數(shù)量較少。 2.凝膠制備： 無論是采用2層凝膠法還是3層凝膠法，都必須嚴(yán)防脫膠的發(fā)生，以保證凝膠的完整性和穩(wěn)定性。 3.試劑配制和操作一致性： 在細(xì)胞裂解、解旋、電泳、中和和染色等步驟中，必須精確配制試劑。所有實驗組所使用的試劑和操作時間必須完全一致，以確保實驗結(jié)果的客觀性和可比性，避免產(chǎn)生偏差。
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