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文獻(xiàn)分析
雜志：Nature（IF=49.962）
標(biāo)題：Nuclear chromosome locations dictate segregation error frequencies
（核染色體的位置決定分離錯(cuò)誤的頻率）
非整倍體是一種細(xì)胞基因組內(nèi)容偏離單倍體集合整數(shù)倍的狀態(tài)，可導(dǎo)致流產(chǎn)和發(fā)育綜合征，并與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞分裂過程中的染色體分離錯(cuò)誤產(chǎn)生非整倍體和微核，可發(fā)生大范圍的染色體重排，如嗜色癥。演化壓力會(huì)形成不同的非整倍體和重排模式，但是尚不清楚分離錯(cuò)誤及微核的初始偏差是否存在于特定的染色體中。
研究思路及研究結(jié)果
1.染色體分離錯(cuò)誤頻率
為了檢查單個(gè)染色體的錯(cuò)誤分離傾向，作者使用單細(xì)胞核型測(cè)序(scKaryo-seq8)來評(píng)估數(shù)百個(gè)有異常有絲分裂的二倍體細(xì)胞的核型。將在G2中同步的RPE1-hTERT細(xì)胞在存在或不存在低濃度(62.5 nM)的Cpd-5(有絲分裂激酶MPS1的小分子抑制劑)的情況下進(jìn)行有絲分裂。低Cpd-5損害了附著錯(cuò)誤糾正和SAC反應(yīng)，導(dǎo)致幾乎所有細(xì)胞都處于晚期，有少量染色體錯(cuò)位和滯后。這些是在癌細(xì)胞中觀察到的最常見的有絲分裂錯(cuò)誤。
易出錯(cuò)有絲分裂4小時(shí)后分離的單個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行scKaryo-seq。低Cpd-5導(dǎo)致了每個(gè)非整倍體細(xì)胞有平均5.5個(gè)分離錯(cuò)誤，總共2417個(gè)可量化的整體和結(jié)構(gòu)染色體拷貝數(shù)改變。
值得注意的是，非整倍體圖顯示染色體之間的分離錯(cuò)誤概率是不相等的:1-5、8、11和X染色體的錯(cuò)誤分離概率顯著高于預(yù)期的4.3%的隨機(jī)錯(cuò)誤頻率(Bonferroni校正，P = 0.0022)。另一方面，14、15和19-22染色體的概率明顯較低。
1、2、4、6、10、11、15和X染色體的著絲粒在后期圖上的熒光原位雜交(FISH)進(jìn)一步證實(shí)了scKaro -seq觀察到的非隨機(jī)非整倍體景觀是由于后期的偏析誤差造成的。
重要的是，當(dāng)用其他方法誘導(dǎo)有絲分裂錯(cuò)誤時(shí)，可以看到類似的分離錯(cuò)誤概率。對(duì)Aurora B的小分子抑制雖然在單層培養(yǎng)中引起了嚴(yán)重的錯(cuò)誤，但在人類腸道類器官中只引起了輕微的分離錯(cuò)誤，從而使子核得以分離。這些核的scKaryo-seq顯示出與Cpd-5處理的細(xì)胞高度相似的分離錯(cuò)誤偏差。綜上可得非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中各種來源的染色體分離錯(cuò)誤是非隨機(jī)的。
2.染色體微核頻率
因?yàn)樵诜蛛x錯(cuò)誤后觀察到初始非整倍體景觀的偏差，作者檢查了這是否會(huì)轉(zhuǎn)化為有偏差的微核含量。通過采用一種可稱之為MN-seq的基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的方法來分離微核并通過測(cè)序評(píng)估其含量，對(duì)Cpd -5處理過的細(xì)胞的單個(gè)或批量排序的微核進(jìn)行MN-seq，顯示出驚人的非隨機(jī)含量，這與染色體錯(cuò)誤分離頻率的模式密切相關(guān)。
然后作者檢查了在自然發(fā)生的癌細(xì)胞微核中微核含量是否是非隨機(jī)的。5個(gè)染色體不穩(wěn)定的癌細(xì)胞系的MN-seq顯示，所有細(xì)胞系都存在非隨機(jī)微核含量，其中兩個(gè)細(xì)胞系(Caco-2和HeLa)的偏性與Cpd-5/ AurBi處理的二倍體細(xì)胞高度相似。數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，各種癌細(xì)胞的分離錯(cuò)誤是非隨機(jī)的，可能是由類似的潛在機(jī)制引起的。
3.非隨機(jī)分離誤差的來源
在確定了微核中錯(cuò)誤分離和捕獲的頻率對(duì)所有染色體都不相等之后，下一步的目標(biāo)是了解這種偏差的起源。比較發(fā)現(xiàn)分離錯(cuò)誤頻率與染色體特征質(zhì)檢沒有相關(guān)性，而RPE1-hTERT細(xì)胞中染色體分離錯(cuò)誤頻率與層相關(guān)的染色體結(jié)構(gòu)域(LADs)密度以及染色體距離細(xì)胞核中心的公布距離密切相關(guān)。
在RPE1-hTERT和其他細(xì)胞中，染色體大小與LAD密度相關(guān)，包括二倍體(TIG3-hTERT和hESCs)和非整倍體(HeLa, U2OS, K562和HT1080)，這表明在廣泛的細(xì)胞系中，較大的染色體比較小的染色體更頻繁地位于核外周。6條染色體(1、2、6、15、17和18)的著絲粒FISH進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，在未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中都是如此。
為了進(jìn)一步探索染色體定位可能導(dǎo)致分離誤差偏差這一命題，作者實(shí)時(shí)成像了標(biāo)記著絲粒和中心體的細(xì)胞在有絲分裂過程中的染色體運(yùn)動(dòng)，并分析了三類染色體的軌跡:中心位置(cen.)、外周位置(位于紡錘極后(pol.))和外周位置(位于紡錘極平面之間(NPP))。
這表明，在未受干擾的條件下，外周染色體比中心染色體需要更長(zhǎng)的時(shí)間來聚集，并且在Cpd-5處理下更容易被錯(cuò)誤分離為錯(cuò)位或滯后的染色體。
在外周染色體中，極性染色體的組裝比非極性染色體慢，錯(cuò)分離的頻率高。僅比較從中期板開始距離相等的極性和非極性外周染色體時(shí)也是如此。在染色體不穩(wěn)定的癌細(xì)胞中也觀察到類似的現(xiàn)象，根據(jù)極性的頻率，外周和極性染色體發(fā)生錯(cuò)位的概率比預(yù)期的高三倍。
此外，在有這種錯(cuò)位的中期染色體的細(xì)胞中，觀察到的后期錯(cuò)位和落后明顯比沒有這種錯(cuò)位的細(xì)胞中更頻繁(分別為18/77和3/112)，表明錯(cuò)誤分離的染色體往往是由錯(cuò)誤排列的染色體引起的。這些觀察結(jié)果表明，染色體的外周定位，更準(zhǔn)確地說是這個(gè)位置與紡錘體極點(diǎn)的關(guān)系，延遲了雙軸取向和聚集，從而導(dǎo)致外周染色體的高頻率錯(cuò)誤分離。
4.核染色體定位的作用
下一步的目標(biāo)是研究間期細(xì)胞核中染色體的不同位置是否直接導(dǎo)致分離誤差概率的變化。在第一種方法中，作者在誘導(dǎo)錯(cuò)誤的后期前將有絲分裂中的染色體位置打亂。這是通過使用單單醇短時(shí)間處理完成的，它允許在單極軸上進(jìn)行基于微管的染色體運(yùn)動(dòng)，同時(shí)使大多數(shù)染色體基本上靠近紡錘極。用scKaryo-seq對(duì)從monastrol劑中釋放到低Cpd-5的單核細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在兩個(gè)不同的細(xì)胞系中，染色體錯(cuò)誤分離的概率發(fā)生了很大的改變。
在第二種方法中，作者利用重復(fù)特異性引導(dǎo)RNAs和熒光標(biāo)記dCas9來成像特定染色體的能力。通常在外圍的染色體偶爾可以在細(xì)胞核內(nèi)部找到，反之亦然。這使得我們可以直接將特定染色體的位置與其有絲分裂中的行為聯(lián)系起來。與從中心位置開始的染色體相比，Cpd -5處理的細(xì)胞在后期開始前，從外圍位置開始的染色體明顯更容易發(fā)生錯(cuò)位(染色體1為三倍，染色體9為四倍)。重要的是，與中心起始位置相比，邊緣起始位置大大增加了錯(cuò)誤分離率(錯(cuò)位和滯后)(染色體1和9分別為1.8倍和2.5倍)。
在最后一種方法中，作者通過雷帕霉素控制的dCas9和Lamin B1二聚體，有條件地將9號(hào)染色體固定在核板上，迫使其從中心位置遷移到外周。用雷帕霉素孵育24小時(shí)后，靠近外周的9號(hào)染色體出現(xiàn)的頻率增加了近兩倍，這本身并沒有影響正常分裂期間的正確分離。然而，在加入Cpd-5后的易出錯(cuò)分裂中，9號(hào)染色體的重定位導(dǎo)致誤分離率比未重定位的9號(hào)染色體增加了近兩倍。綜上所述，染色體分離錯(cuò)誤頻率直接受有絲分裂開始前間期核位置的影響。
研究結(jié)論
外圍染色體比中心染色體錯(cuò)誤分離的頻率更高，因?yàn)樗鼈冃枰吒h(yuǎn)的距離才能到達(dá)中期板。且更經(jīng)常發(fā)生側(cè)向微管相互作用和/或由于位于紡錘柱后而經(jīng)歷額外的延遲。盡管如此，來自不同潛在過程的其他偏差仍可能存在，并可能影響人類女性減數(shù)分裂中的非整倍體。值得注意的是，染色體大小也與人類胚胎最初幾次易出錯(cuò)的有絲分裂后的非整倍體景觀相關(guān)。
因此，非隨機(jī)分離誤差可能影響癌癥中反復(fù)出現(xiàn)的非整倍體和基因組重排模式的動(dòng)力學(xué)，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。組織特異性的染色體位置可能會(huì)對(duì)這些動(dòng)態(tài)產(chǎn)生不同的影響。